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• 1. 서 론
• 2. 실 험
• 2.1. 재료
• 2.2. 미세유체시스템 칩 제작
• 2.3. 미세유체시스템내부에 효소가 고정된 마이크로어레이 제조
• 2.4. 분석기기
• 3. 결과 및 고찰
• 3.1. 미세유체시스템 칩 개발
• 3.2. 미세유체시스템 내부에 단백질이 고정된 마이크로 어레이 제조
• 3.3. 에탄올 측정
• 4. 결 론
• Acknowledgement

1. 서 론

미세유체 시스템을 기반의 바이오센서는 적은 양의 샘플 소비와 빠른 측정시간을 지니며 다중채널 구조를 이용하여 동시에 여러 분석을 진행할 수 있으며 시료의 분리, 정제, 혼합, 반응, 세척 등의 전 처리부터 검출까지의 작업을 하나의 칩 위에서 수행할 수 있기 때문에 장치의 소형화 (miniaturization) 및 집적화(integration)를 효과적으로 가능하게 한다. [1] 이러한 점을 이용하여 지난 수년간 Pointof-care 시스템을 위한 진단용 칩[2], 유기합성[3], 세포배양[4] 등 생물학에서부터 고분자, 화학, 의학 등을 포함하여 다양한 분야에 걸쳐 미세유체시스템을 이용한 바이오센서에 관한 다양한 연구가 진행되어 왔다. 

바이오센서가 기존의 센서와 구별되는 점은 생체물질의 선택적인 반응 및 결합을 이용하는 것이므로 바이오센서의 실용화에 있어서 가장 중요한 점은 생체반응물질의 고정화 기술이라 할 수 있다. 기존의 바이오센서는 생체반응물질을 유리, 플라스틱, 실리콘 기판 등에 고정시키기거나 2차원적 평면을 이용한 고정화 방법을 사용하였다.[5] 이러한 방법은 고정된 생체반응물질의 물리적·화학적 변성으로 인해 반응이 제대로 이뤄지지 않으며 고정화 반응이 까다롭다는 단점을 가진다. [6,7] 

따라서 본 연구에선 미세유체시스템 내부에 생체반응물질인 효소가 고정된 PEG 하이드로젤 마이크로어레이를 제조하여 바이오센서에 응용하였다. 세계적으로 안정성이 입증된 PEG를 재료로 합성한 고분자 하이드로젤 내부에 효소가 고정될 경우, 하이드로젤에 함유된 높은 수분 함유량에 의해 효소의 안정성이 장기간 유지될 수 있으며, 하이드로젤에 의해 물리적 충격 및 화학적 물질로부터 보호받아 활성을 오래도록 유지할 수 있다. 또한 연구에 사용된 미세유체시스템은 여섯 줄의 다중 미세채널 구조를 가지며 각각 여섯 개의 채널에서 독립적인 반응이 가능함으로, 여러 농도의 알코올을 동시에 분석할 수 있었다. 

2. 실 험

2.1. 재료

분자량이 Mn=575인 Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEG-DA), 광개시제로 사용한 2 - hydroxy-2-methylpropiophenone
(HOMPP), alcohol oxidase (AOX, from Pichia pastoris, 10–40 units/mg protein), hydrogen peroxidase (POD, from horseradish type II, 200 unit/mg solid), alcohol 은 Sigma Aldrich chemical (MO, USA)에서 구매하였고 Amplex Red reagent 와 reaction buffer 는 Molecular Probe (Carlsbad, CA, USA)에서 구매하였으며 Poly(dimethylsiloxane) (PDMS)는 Dow Corning Sylgard 184를 구매하였다. 양각형태의 패턴을 제조하기 위해서 SU-8 50과 developer용액은 Microchem (MA, USA)에서 구매하였으며 AUTO CAD를 이용하여 디자인된 포토마스크는 standard laser jet printer (LaserWriter 16/600 PS, Apple Inc., Cupertino, CA, USA)를 이용하여 제조하였다. 

2.2. 미세유체시스템 칩 제작

미세유체시스템 칩은 SU-8을 이용한 포토리소그래피기술을 이용하여 제작한다. 실리콘기판 위에 SU-8 50을 코팅하고 (3000rpm, 30초) 여섯 줄의 채널이 디자인 된 포토마스크를 이용하여 UV를 10～20초 조사하면 빛을 받은 부분은 중합이 일어나 단단히 굳어지고 빛을 받지 않은 부분은 developer를 이용하여 제거할 수 있다. PDMS와 가교제를 10:1 비율로 균일하게 혼합한 후 기포를 완전하게 제거하고 이를 실리콘 마스터 위에 붓는다. 65℃에서 5시간 가교시켜 떼어낸 후 주입을 원하는 부분의 PDMS를 주사기 바늘을 이용하여 연결라인을 형성한다. 채널이 포함된 PDMS와 TPM(3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate)이 처리된 유리기판은 O₂플라즈마를 이용하여 각 물질들의 표면을 활성화 시키고 접촉을 통해 마이크로 칩을 형성할 수 있다. TPM은 methacrylate groups을 가지고 있어 PEG 하이드로젤 제조 시 하이드로젤과 유리기판 사이의 공유결합을 통해 고정해주는 역할을 하는 물질이다.

2.3. 미세유체시스템내부에 효소가 고정된 마이크로어레이 제조

미세유체시스템을 이용하여 내부에 효소가 고정된 마이크로어레이 제조는 Scheme 1을통해 간략하게 보여준다. UV에 의해 라디칼을 형성하는 물질을 개시제로 이용할 경우, PEG-DA용액은 negative photoresist 와 같은 성질을 가지게 되어 광개시제와 PEG-DA 용액을 UV로 조사하게 되면 손쉽게 하이드로젤을 제조할 수 있으며, 하이드로젤의 물리/화학적 성질들을 PEG 분자량을 변화시키면서 조절할 수 있다. 미세유체시스템 내부에 효소를 포함한 하이드로젤 마이크로어레이 제조는 분자량이 Mn=575인 PEG-DA 500μL, 광개시제 20μL, 효소 (1mg/mL) 300μL, 증류수 180μL를 포함한 전구용액을 채널 내부로 흘려주고 원하는 모양으로 디자인된 포토마스크를 통해 광 가교시켜 제조하였다.

Scheme 1. Schematic illustration of fabricating arrays of hydrogel microstructures entrapping AOX within microfluidic devices

2.4. 분석기기

본 논문의 광학 및 형광이미지는 높은 분해능의 CCD 카메라 (Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY, USA)를 포함한 형광현미경 Zeiss Axiovert 200 microscope을 사용하여 측정하였다. 측정된 이미지들은 이미지 프로그램인 image analysis software (KS 300, Carl Zeiss Inc.) 을 이용하여 분석하였다. 

3. 결과 및 고찰

3.1. 미세유체시스템 칩 개발

미세유체시스템의 칩 공정은 포토리소그래피(photolithography)를 통해 제작한다. Figure 1은 여섯 줄의 채널 모두 독립적으로 입구와 출구가 존재하고 여섯 줄의 채널을 포함한 실리콘마스터의 광학 이미지와 (a-b) PDMS 칩의 광학이미지(c-d)를 나타내었다. 미세유체시스템 칩에 대한 전체적인 크기는 3cm x 1.3cm 이며 채널의 크기는 너비 100μm와 높이 30μm 을 가진다.

Figure 1. Optical image of (a-b) silicon mold in the region of microchannels which were used to cast PDMS, (c-d) subsequent PDMS device made from silicon mold

3.2. 미세유체시스템 내부에 단백질이 고정된 마이크로 어레이 제조

Figure 2a은 효소 대신 FITC-BSA(Fluorescein isothiocyanate labelled bovine serum albumin, 1mg/mL)를 포함한 하이드로젤 마이크로어레이의 광학이미지를 보여 준다. 이를 통해 채널 내부의 PEG 하이드로젤 마이크로어레이가 성공적으로 제조 되었음을 확인할 수 있다. Figure 2b에서 보듯이 하이드로젤 마이크로어레이에 고정된 FITC-BSA는 녹색형광을 띄며 하이드로젤 마이크로어레이 내부에서 누출 없이 고정되어 있는 것을 확인할 수 있다. Figure 2c에서 보듯이 형광강도를 측정한 결과 여섯 줄의 채널 모두 고른 분포의 형광강도를 가진 것을 확인하였고 비슷한 양의 FITC-BSA가 고정되었음을 알 수 있다. 

Figure 2. Fabrication of hydrogel microarrays entrapping FITC-BSA within microchannels. (a) Optical image of a hydrogel microstructure fabricated in microchannels and (b) Fluorescence image. (c) Fluorescence intensity profile of hydrogel microstructures in single microchannel

3.3. 에탄올 측정

AOX와 POD가 고정된 하이드로젤 마이크로어레이 및 Amplex Red 라는 시약을 이용해 에탄올 농도를 측정하였다. Scheme2에서 보듯이 POD 의 존재 하에 Amplex Red 는 H₂O₂와 1:1 반응을 통해 resorufin이라는 붉은 색의 형광산화물을 생성한다. 에탄올과 AOX가 반응할 경우 H₂0₂가 생성되므로, 에탄올의 농도가 높을수록 더 많은 H₂0₂가 생성되어 resorufin의 형광강도가 더 강해진다. Figure 3a와 같이 미세유체시스템 내부에 AOX 및 POD가 포함된 하이드로젤 마이크로어레이를 제조하고 Amplex Red reagent(10mM) 에탄올을 각각 흘려주어 형광의 변화를 측정하였다. 에탄올의 농도를 0, 2, 4, 6, 8, 10mM 을 각각 반응시킴으로써 형광의 강도가 증가한 것을 확인하였으며 이를 그래프로 나타내었다. (Figure3b) 

Scheme 2. Principle of coupled enzymatic assays using Amplex Red reagent. Oxidation of alcohol by alcohol oxidase results in generation of H₂O₂, which is coupled to conversion of the Amplex Red reagent to fluorescent resorufin by POD

Figure 3. Detection of alcohol using enzymeentrapped hydrogel microarrays within microfluidic device. (a) Fluorescence image obtained after solution containing alcohol and Amplex Red was reacted with hydrogel microarrays (b) Change of fluorescence intensity within hydrogel microarray according to alcohol concentration

4. 결 론

본 연구는 미세유체시스템 칩 제작 공정 및 광학적 투과도가 좋은 PDMS 칩을 제조하여 효소 기반의 하이드로젤 마이크로어레이 제조방법을 제안하였다. PEG 하이드로젤은 광중합을 통해 효소를 물리적으로 내부에 고정할 수 있으며 원하는 모양과 사이즈의 포토마스크를 디자인하여 다양한 크기의 하이드로젤 마이크로어레이를 손쉽게 제조할 수 있었다. 에탄올과 알코올 옥시다아제의 산화반응을 통해 나오는 생성물인 H₂0₂는 POD와 반응하면 무색의 Amplex Red reagent를 붉은 형광을 갖는 resorufin으로 변환하며 이러한 과정을 통해 형광의 강도에 따라 에탄올의 농도를 측정할 수 있었다. 여섯 줄의 미세채널을 이용할 경우 한 번에 여러 농도의 에탄올을 측정할 수 있으며 다섯줄은 알고 있는 에틸 알코올농도에 대한 표준곡선을 얻고 나머지 하나의 채널에 혈액을 흘려줌으로써 혈액 속의 알코올의 농도를 알 수 있는 시스템으로 사용이 가능하며 이와 같은 연구는 에탄올에만 국한된 것이 아니라 H₂0₂가 반응생성물인 모든 산화효소의 반응에 사용될 수 있을 것이다. 

Acknowledgement

이 연구는 한국연구재단이 후원하는 선도연구센터지원사업 (R11-2007-050-03002-0)을 통해 수행되었음.